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2022-08
Citation 導言 結直腸癌(CRC)是第三大常見(jiàn)癌癥，占全球所有新癌癥病例的10%，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，導致2020年近100萬(wàn)人死亡，且年輕者發(fā)病率不斷上升[1,2]。在中國，結直腸癌的新發(fā)病人數僅次于肺癌，成為第二大癌癥，據最新數據，我國83%的結直腸癌患者在首次確診時(shí)處于中晚期，其中44%的患者已經(jīng)出現了肝、肺等部位的轉移。盡管當前結直腸癌的治療策略有了進(jìn)步，但結直腸癌患者的預后僅略有改善，而開(kāi)發(fā)新治療方法PI3K/mTOR抑制劑對攜帶RNF43 p.G659fs突變的結直腸癌患者是否具有治療應用價(jià)值亟待對疾病機制的了進(jìn)一步了解，確定關(guān)鍵基因變異的特定功能對于促進(jìn)新的靶向治療方法至關(guān)重要，并最終改善患者的預后。
研究背景
RNF43基因（Ring Finger Protein 43）編碼一種環(huán)型E3泛素連接酶，它作為Wnt信號通路的負調節因子主要是通過(guò)降解Wnt受體Frizzled來(lái)實(shí)現。因此，RNF43功能的喪失將導致腫瘤細胞依賴(lài)分泌的Wnt配體來(lái)存活[3-5]。 RNF43是CRC和其他惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生突變的基因，且RNF43 p.G659fs突變在約8%的CRC患者中出現，尤其是在DNA錯配修復缺陷(dMMR)/高微衛星不穩定性(MSI-H)的患者中更常見(jiàn)[6]，但其作為熱點(diǎn)突變的功能影響還有待進(jìn)一步研究，且也沒(méi)有針對的特定療法，探索其中機制對新療法開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。 本文小編將帶大家一起看看這篇刊登于Nature Communications的文章：RNF43 G659fs is an oncogenic colorectal cancer mutation and sensitizes tumor cells to PI3K/mTOR inhibition（譯名：結直腸癌致突變RNF43 G659fs可使腫瘤細胞對PI3K/mTOR抑制劑敏感），從機制上探索PI3K/mTOR抑制劑對攜帶RNF43 p.G659fs突變的結直腸癌患者是否具有治療應用價(jià)值。
研究背景
RNF43659mut具有不依賴(lài)Wnt的致癌作用 為研究RNF43上兩個(gè)熱點(diǎn)移碼突變（p.R117fs和 p.G659fs）的功能。經(jīng)過(guò)CRISPR-Cas9編輯構建的RNF43117mut和RNF43659mut等基因細胞系。在培養之初加入Wnt-3a，結果顯示，與對照組相比，RNF43117mut組在加入Wnt-3a后生長(cháng)顯著(zhù)加速。而RNF43659mut組沒(méi)有明顯差別（圖1）。且RNF43659mut組增加了三個(gè)株系聚落形成（圖1），而這些聚落的形成與Wnt-3a和APC無(wú)關(guān)。表明了RNF43117mut的功能是Wnt依賴(lài)性的，而RNF43659mut不是。為了進(jìn)一步驗證結果，使用TOP/FOP熒光素酶報告分析測量Wnt信號活性。發(fā)現補充Wnt-3a的RNF43117mut組顯著(zhù)增加Wnt信號。與對照組相比，RNF43659mut組Wnt信號未顯著(zhù)增加（圖2） 圖1 圖2 （注：熒光素酶報告物測定所示CRISPR編輯細胞中的Wnt信號活性） RNF43659mut激活PI3K/AKT信號通路，易受PI3K/mTOR抑制劑的影響 為了發(fā)現RNF43659mut CRC細胞潛在的治療藥物，對RNF43659mutCRC細胞進(jìn)行了全面的藥篩。在5363種處于臨床前和臨床開(kāi)發(fā)不同階段的化合物列表中，分別篩選出了30種和22種PI3K/mTOR途徑的藥物。與二甲基亞砜處理和等基因對照相比，該途徑在選擇性靶向RNF43659mut的重組文庫化合物中顯著(zhù)富集（圖3）。發(fā)現五種化合物alpelisib，PF-04691502，PKI-179，Torin-1和Torin-2，在RNF43659mut等基因細胞系中表現出顯著(zhù)的選擇性殺傷效果（圖4，6）。此外，對RNF43 p.G659fs 過(guò)表達細胞中使用五種化合物的劑量-反應曲線(xiàn)中，五種化合物對RNF43659mut細胞和過(guò)表達RNF43659mut細胞顯示出有效和選擇性毒性，但對sgRNA對照細胞或野生型過(guò)表達細胞沒(méi)有毒性（圖5）。這些結果共同證明了RNF43659mut激活PI3K/AKT信號，PI3K/mTOR抑制劑可以靶向殺傷RNF43659mut突變的腫瘤。 圖3 圖4 圖5 Venn圖顯示HT29、LS513 RNF43659mut編輯細胞和HCT116 RNF43659mut過(guò)度表達細胞中PI3K/mTOR顯著(zhù)候選化合物重疊（紅色），其中n為在每個(gè)細胞系的二次篩選中驗證的主篩選中的化合物數量 圖6 CRC RNF43 G659fs臨床前模型中PI3K/mTOR復合效率的評估 RNF43659mut通過(guò)RNF43659mut-p85相互作用激活PI3K/AKT信號 研究發(fā)現RNF43 p.G659fs突變在體外和體內激活PI3K，并表明這種激活是通過(guò)降解PI3K調節亞基p85發(fā)生的。在突變體中，RNF43 p.G659fs通過(guò)結合降解p85來(lái)消除p85對PI3K/AKT信號的抑制，從而激活PI3K/AKT信號，加快癌細胞的生長(cháng)，并且RNF43 p.G659fs誘導的PI3K/AKT信號激活可以被PI3K/mTOR抑制劑逆轉。這也進(jìn)一步證明PI3K/mTOR抑制劑能通過(guò)直接抑制PI3K/AKT信號，從而抑制攜帶RNF43 p.G659fs突變腫瘤細胞的生長(cháng)。 圖7 泛素免疫沉淀分析評估觀(guān)察到RNF43659mut增加了P85的泛素化 RNF43659mut調節干擾素基因表達 研究對RNF43659mut等基因細胞系的RNA測序揭示了降低干擾素-α和-γ反應的基因表達，這些基因集分別有助于炎癥反應和先天性免疫反應，且這種降低的活性可以被PI3K/mTOR抑制劑恢復，這說(shuō)明RNF43659mut可能改變腫瘤免疫環(huán)境。
研究結論
本研究證明了RNF43 p.G659fs突變具有不依賴(lài)Wnt的致癌作用，RNF43 p.G659fs與p85亞基結合降解，消除p85對PI3K/AKT信號通路的抑制作用，可導致PI3K信號增強，因而PI3K/mTOR抑制劑可以逆轉p.G659fs誘導的PI3K/AKT信號通路的激活，它可對攜帶該突變的結直腸腫瘤選擇性殺傷。驗證了PI3K/mTOR抑制劑在治療RNF43 p.G659fs突變型癌癥中具有應用價(jià)值，另外基于RNF43659mut調節干擾素基因表達，也提出了將免疫治療和PI3K/mTOR抑制劑結合進(jìn)行治療的可能性，尤其是治療失敗的DNA錯配修復缺陷(dMMR)/高微衛星不穩定性(MSI-H)結直腸癌患者。因此對RNF43 p.G659fs突變型結直腸癌的研究發(fā)現為未來(lái)治療新方法的開(kāi)發(fā)拓展了新視野。
研究啟示
文中建立了CRC患者來(lái)源的類(lèi)器官，腫瘤組織取自患者來(lái)源的RNF43_G659fs異種移植模型。同時(shí)也建立正常的患者來(lái)源的結腸類(lèi)器官。應用類(lèi)器官進(jìn)行藥物處理，驗證了PI3K/mTOR抑制劑在RNF43659mut等基因細胞系和異種移植模型(PDX)，以及在患者來(lái)源的含有RNF43 p G659fs突變的類(lèi)器官中都產(chǎn)生了良好的抗腫瘤活性。 作者之所以如此選擇，因為不同的模型都有其自身的局限性，細胞系包含的細胞類(lèi)型過(guò)于單一，喪失了腫瘤的異質(zhì)性。而人源腫瘤異種移植模型，不僅存在人鼠之間物種的差異，而且成本高昂、建模周期長(cháng)和建模成功率低，也無(wú)法高通量使用等問(wèn)題。相比來(lái)說(shuō)，類(lèi)器官具有擬合度高、培養周期短、傳代穩定、易自動(dòng)化等優(yōu)勢，具備了高通量使用的條件。 類(lèi)器官技術(shù)是科技部發(fā)布了“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃的6個(gè)重點(diǎn)專(zhuān)項之一，由于類(lèi)器官技術(shù)本身具有極高的創(chuàng )新性，類(lèi)器官已成為疾病研究、新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域最受矚目的模型，深受基金項目申請和高分雜志的青睞，使用類(lèi)器官發(fā)表文章及申請國自然都是很有優(yōu)勢的。 廣州精科醫學(xué)檢驗所有限公司 廣州精科醫學(xué)檢驗所有限公司是精科生物集團旗下的全資子公司，是一家以類(lèi)器官技術(shù)+基因組學(xué)技術(shù)為雙驅核心的第三方醫學(xué)檢驗所。公司在類(lèi)器官方向致力于推動(dòng)類(lèi)器官技術(shù)的轉化與應用，在科研上打造全面的類(lèi)器官技術(shù)服務(wù)體系，而在臨床上提供高效的類(lèi)器官+NGS的綜合檢測服務(wù)。 ★ PIC.08 精科腸癌類(lèi)器官 HE圖片 參考文獻 [1]Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J. Clin. 70, 7–30 (2020). [2]Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, 330–337 (2013). [3]Wong, C. C. et al. SLC25A22 promotes proliferation and survival of colorectal cancer cells with KRAS mutations and xenograft tumor progression in mice via intracellular synthesis of aspartate. Gastroenterology 151, 945–960 (2016). [4]Liu, X. et al. Inhibition of PCSK9 potentiates immune checkpoint therapy for cancer. Nature 588, 693–698 (2020). [5]Roig, A. I. et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology 138, 1012–1021 (2010). [6]Zhang, L. et al. Selective targeting of mutant adenomatous polyposis coli (APC) in colorectal cancer. Sci. Transl. Med. 8, 361ra140 (2016).
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