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2020-10
下呼吸道感染是臨床最常見(jiàn)的感染性疾病之一， 具有很高的病死率。根據世界衛生組織 （ＷＨＯ）2018年公布的2016年統計數據，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在傳染性疾病中位列第一，共導致約300萬(wàn)人死亡。
2002年非典型肺炎（SARS），2003年新型H1N1甲型流感，2013年H7N9流感病毒，以及2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情爆發(fā)，對人類(lèi)的生命健康造成嚴重威脅。可見(jiàn)，呼吸道感染對人類(lèi)健康的威脅有不斷增加的趨勢。
呼吸道感染病原早期診斷對于迅速有效控制急性呼吸道感染發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要作用！
由于各種呼吸道病毒感染的臨床癥狀相似，醫生難以簡(jiǎn)單地通過(guò)體征做出病原學(xué)診斷。
為了及時(shí)控制病情，臨床上常常采取經(jīng)驗性用藥，待得到培養結果及藥敏測試結果后再進(jìn)行調整。但這也容易導致抗菌藥物使用不當，使病原微生物耐藥性出現及蔓延的概率增加，導致下呼吸道感染的診斷和治療更為棘手，成為當今全球共同面臨的重大衛生挑戰。因此，開(kāi)發(fā)新的、更準確及高通量的下呼吸道感染病原微生物檢測方法具有重要意義。
近些年來(lái)，出現了改良細胞培養法分離并鑒定病毒，使其滿(mǎn)足臨床診斷的要求。不同的細胞種類(lèi)對病毒敏感程度不同，接種未知標本就要選用多種不同的細胞系，工作量大，不利于臨床實(shí)驗室操作。因此出現了將不同種類(lèi)的細胞混合起來(lái)制備成單層細胞的方法，可提高檢測靈敏度。R-Mix是水貂肺細胞和A549的混合細胞，用來(lái)檢測呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）、流感病毒及腺病毒（ADV）。而隨著(zhù)病毒特異性單克隆抗體的出現，可在產(chǎn)生CPE之前對病毒進(jìn)行鑒定，縮短病毒檢測的時(shí)間。這些方法雖經(jīng)改良，但細胞培養操作耗時(shí)、敏感性低、技術(shù)要求高的問(wèn)題未得到根本解決，因此在國內仍未能得到廣泛應用。
直接免疫熒光法是目前臨床最為常用的快速診斷方法之一。該方法使用熒光素標記的抗病毒單克隆抗體檢測呼吸道上皮細胞中的病毒抗原，大約2h就能判斷結果。但該方法的檢測結果受樣本的質(zhì)量和處理過(guò)程影響較大，要求標本中有一定量的呼吸道上皮細胞，否則會(huì )造成假陰性的結果。
膠體金免疫層析法利用免疫層析的原理，通過(guò)抗原抗體結合，以膠體金為示蹤物呈現顏色反應，從而判斷樣本中是否存在檢測的抗原或抗體。該檢測方法具有特異性強、操作簡(jiǎn)單、重復性好、方便快捷（一般能在10～30min獲得結果）且不需要特殊設備和儀器等優(yōu)點(diǎn)，因而非常適合臨床早期診斷和出入境等機構的現場(chǎng)篩查，但是其敏感性低于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應（Realtime RT-PCR），該檢測方法的結果僅能作為初步參考。
呼吸道病毒感染是臨床最常見(jiàn)的疾病之 一，病原學(xué)復雜，準確的病原學(xué)診斷是合理選擇治療方案的基礎。
核酸檢測法是檢測病毒保守特異的核酸序列，可將病毒鑒定到種。臨床實(shí)驗室中應用最廣泛的是PCR技術(shù)，利用互補引物特異性指數擴增病毒基因組中的片段?；赑CR技術(shù)及其衍生的熒光PCR和多重PCR技術(shù)，對病毒核酸檢測靈敏度和特異性均較高（比傳統病毒培養方法敏感3.8倍左右），但實(shí)驗條件要求嚴格，單次檢測種類(lèi)有限，且成本較高。另外，有些病毒一旦感染后就會(huì )永久寄生在宿主體內，病毒核酸檢測過(guò)于敏感，即使擴增結果陽(yáng)性未必代表患者處在某種病毒的急性感染期。
病原微生物宏基因組檢測法（mNGS）
宏基因組學(xué)（Metagenomics）也叫微生物環(huán)境基因組學(xué)。通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA,構建宏基因組文庫，利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。它是在微生物基因組學(xué)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種研究微生物多樣性、開(kāi)發(fā)新的生理活性物質(zhì)（或獲得新基因）的新理念和新方法。
宏基因組二代測序，英文為“Metagenomics Next Generation Sequencing”,即mNGS，利用高通量測序，對樣本中的核酸進(jìn)行測序，可一次并行獲取標本中的人源核酸序列信息和外源病原微生物核酸序列信息，將獲得的序列與人類(lèi)基因組序列庫和病原體微生物基因組序列庫進(jìn)行比對注釋?zhuān)纯蓪?shí)現病原微生物的鑒定。
宏基因組檢測覆蓋已知的所有病原，對感染標本直接進(jìn)行檢測，無(wú)需預設，直接檢測。包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)，以及支原體等，都可以“一網(wǎng)打盡”，為臨床中呼吸道感染提供快速精準診斷依據。
宏基因組測序和傳統檢測方法學(xué)在病原檢測方面的時(shí)效性比較示意圖：
（病毒在多種方法學(xué)中的檢測中時(shí)效性的對比）
膠體金免疫層析法：第3-7天；流式細胞法：第1-10天；傳統免疫熒光法：第1-10天；核酸檢測法：第0.5-20天；血清IgM：第5天后；IgG檢測法：第15天后；mNGS法：1-2天。
總結：
通過(guò)分析比較，傳統的培養法雖然是檢測下呼吸道感染病原體的“金標準”，但通常需要2-4ｄ甚至更長(cháng)時(shí)間?？乖椒z測結果對樣本的質(zhì)量要求高，否則容易造成假陰性的結果。血清學(xué)方法存在通量低，易出現假陽(yáng)性結果等缺陷。核酸檢測方法雖然是目前最快速的選擇，但其單次檢測種類(lèi)有限。目前宏基因組病原體檢測優(yōu)勢明顯，具有快速檢測、全面覆蓋、準確性高等優(yōu)勢，適合于呼吸道感染的各個(gè)階段，尤其是對早期診斷意義重大，已經(jīng)逐步成為病毒診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢。
呼吸道感染臨床早期診斷有利于避免抗生素的濫用，根據病原體的不同正確地進(jìn)行抗病毒治療；有利于降低院內傳播風(fēng)險；有利于開(kāi)展個(gè)體化診療以降低患者整體治療費用；并為早期預防和治療提供病原學(xué)的有力支撐和實(shí)驗室的明確診斷。
參考文獻：
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